酵素工学ニュース　第78号　pp.10-13（2017）

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１．はじめに
抗生物質は微生物の作る抗菌活性を有する天然物である。微生物は様々な自然環境に適応するために、多様な化学構造を有する天然物を生産することが知られており、それらは抗生物質をはじめとする様々な生物活性を有する。これら天然物の中でもペプチド系化合物は大きな割合を占めていることから、これらの天然ペプチド骨格を合理的に設計できるようになれば、医薬品をはじめとした有用物質の創製につながることが期待できる。本稿では天然ペプチド化合物のモデルとして我々の発見したゴードスポリンを用い、in vitroでの完全合成及びアナログ体の簡便な合成系の構築について概説する。

1-1　リボゾームを介して作られる抗生物質
微生物の生産する二次代謝産物として知られているペプチドには、大別してリボゾ−ムを介して作られるRiPPs (Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides)1)とNRPs (Non-ribosomal peptides)2)がある。乳酸菌などが作るバクテリオシンなど一部を除き、これまでほとんどのペプチド系天然物質は後者のNRPsと考えられていたが、天然物生合成研究の進展に伴い2005年頃からリボゾームを介して合成されるRiPPsが放線菌3)、シアノバクテリウム4)などから発見されるようになった。現在では、バクテリア全般をはじめ、アーキア5)、糸状菌6)などからも報告されており、RiPPsは微生物が普遍的に生産する二次代謝産物であると考えられている。

２．放線菌Streptomyces sp. TP-A0584が生産するRiPPs・ゴードスポリン
ゴードスポリンは2001年に放線菌Streptomyces属の二次代謝と形態分化を広く促進誘導する化合物として発見された7) (図1AB)。ゴードスポリンは19個のアミノ酸からなるペプチド化合物であり、その内部には含窒素複素五員環であるアゾールやデヒドロアラニン (Dha) 構造が存在し、これらのペプチド修飾構造が化合物構造に安定性を与えている (図1A)。当初、ゴードスポリンもNRPであると考えられていたが、アミノ酸の立体構造がすべてL体であること、19残基はNRPとしてはサイズが大きいことなどから、リボゾームを介した生合成機構であることが推測され、生合成遺伝子のクローニングの過程でゴードスポリンの前駆体ペプチド配列をコードする遺伝子godAが発見されたことから、RiPPsであることが証明された3)。

３．ゴードスポリン生合成経路
ゴードスポリン生合成遺伝子クラスターは10個のgod遺伝子からなる (図1C)。まず、前述のgodAが転写・翻訳され、GodAペプチドとなる。GodAは全長49残基からなり、そのN末側30残基はRiPPsにおいてリーダーペプチドと呼ばれている領域であり、翻訳後修飾酵素が基質認識を行うために必要な配列である。そして、C末側19残基がゴードスポリンのアミノ酸配列に対応し、コアペプチドと呼ばれている。翻訳されたGodAは翻訳後修飾酵素GodD、GodE、GodF、GodG、GodHによって翻訳後修飾を受ける (図2)。最初に、コアペプチド内の6カ所のSer、Thr、Cys残基が、それぞれオキサゾール、メチルオキサゾール、チアゾールへと変換されるがこれは2段階の反応で進行する。最初にGodDが6カ所のSer、Thr、Cys残基で脱水環化反応を触媒することでアゾリン環が生成する。この過程ではアミノ酸側鎖のヒドロキシル基・チオール基がペプチド結合のカルボニル基を求核攻撃することで五員環が生成する。生じた中間体の酸素原子が一度リン酸化された後、リン酸が脱離することでアゾリンが生成すると提唱されている。このリン酸化にはATPが使われる。その後、GodEの酸化反応により、脱水素されアゾール環となる (図2A)。次に2カ所のSer側鎖の脱水により、Dha構造が形成されるが、この反応は正確には脱水反応ではない。本反応に関与するGodFはグルタミル-tRNAGluを基質としてSer側鎖の水酸基をグルタミル化する。続くGodGによりGluが脱離することでDhaが形成される (図2B)。本反応機構はNisinなどのLantibioticsのランチオニン構造形成時に一時的に作られるDhaの形成反応と同じ反応機構である8)。最後にN末端領域のリーダーペプチドが消化された後、生じたアミノ基がGodHによってアセチル化されることでゴードスポリンが生合成される (図2C)。アゾール形成酵素をはじめとしてRiPPsにおける翻訳後修飾酵素の多くで、リーダーペプチドに対する特異性が高く、コアペプチドへの特異性が比較的低いことが知られている。実際に、コアペプチドへ変異を導入して前駆体ペプチドのアミノ酸残基を置換しても、通常と同様に翻訳後修飾を受けて類縁体が生産される例が多く知られている。このことから、RiPPsの生合成経路を利用した多様なペプチド化合物の創製が期待されている。

４．試験管内でのゴードスポリン完全合成と52種類のアナログ体の創製
著者らは、再構成無細胞翻訳系と翻訳後修飾酵素を組み合わせることで、人工的に合成したgodAの転写・翻訳からN -アセチル化反応までの全ての工程を、一つの試験管内で連続的に行い、ゴードスポリンの全合成を達成した (図3)9)。このように遺伝子の転写翻訳から翻訳後修飾までの全ての工程を試験管内で再構成したRiPPs生合成系は世界初である。

本手法では、構造配列を含むわずか200塩基対程度のテンプレートDNAさえ用意すれば、ゴードスポリンやその類縁体RiPPsを簡便かつ迅速に合成することが可能である。大腸菌のリボゾームを用いた無細胞翻訳系に、ゴードスポリンの翻訳後修飾に必要な酵素群を加えることで、テンプレートDNAの翻訳からゴードスポリンの合成までがほぼ一日で完了する。この利点を活かして、全部で52種類のGodA変異体を作製し、翻訳後修飾酵素の基質特異性の検討に供した。さらに、各変異体が受けた翻訳後修飾反応を精査することで、翻訳後修飾酵素の基質特異性を明らかにすることもできた。アゾール環形成酵素は、修飾を受けるSer、Cys、Thrとその両隣の残基で構成される3残基の配列を認識して、アゾール環を導入することが明らかとなった。このアゾール環形成酵素の性質は、ゴードスポリンの構造が2もしくは3残基の等間隔にアゾール環が配置されていることと整合性がとれる。

得られたアゾール環形成の性質に基づき、新たにSerとAlaの2残基をゴードスポリンの中央部位に挿入したGodA*-10SA11を設計したところ、予想通り新たに作られた3残基の認識配列に7つ目のアゾール環を導入することに成功した。また、GodAのC末端領域19残基の配列を反復させ38残基にしたGodA*-tandemを用いることで、12か所のアゾール環を有するアナログの創製にも成功した。

５．放線菌宿主を用いたゴードスポリンアナログ体の大量生産法の確立
さらに、試験管内反応から得られた知見を、遺伝子組換え放線菌を宿主とした発酵生産系においても検討した。以前の研究3)で生産菌TP-A0584のゲノム遺伝子を組換えることにより、アナログ体の生産が可能な株が作製されており、これを利用することでin vivoにおける翻訳後修飾反応を検討した。GodA*-10SA11を前駆体として生産するよう遺伝子組換え操作を行うと、目論見通り、新規1カ所を含む計7カ所のアゾール環と2カ所のDhaが翻訳後修飾された新規ゴードスポリンアナログ・GS-10SA11が生産されることがわかった (図4A)。この発酵生産系では、NMR解析による化学構造決定を行うのに十分な量のGS-10SA11の生産に成功した。同様の方法を用いて、GodA*-tandemが修飾されたGS-tandemを生産できることも確認できた (図4B)。

本結果により、in vitroでの結果をシームレスにin vivo発酵生産へとつなげることが可能となり、ゴードスポリンアナログ体の迅速な発酵生産が実現できるようになった。

６．おわりに
以上のように、多種類の前駆体を簡便・迅速に合成できる無細胞翻訳系の利点を生かして、ゴードスポリンにおける翻訳後修飾のルールの一端を明らかにすることができた。今後、より詳細に解析を進めることで、ゴードスポリンの類縁体がより自在にデザインできるようになることが期待できる。また、本手法は他のRiPPs生合成系にも適用可能であることから、ゴードスポリンに限らず、今後さまざまなRiPPs生合成経路の解析が加速度的に進むことも期待できる。遺伝子への変異導入という遺伝子工学的な手法での類縁体創製が可能なことから、RiPPsは新たな生物活性物質創製のための魅力的なターゲットであり、本研究成果はRiPPs生合成経路のエンジニアリングに重要な指針を示すことができたと考えている。

謝辞
本研究を行うにあたり、山下湖奈さん、下村杜人さん、林昌平博士、後藤佑樹准教授、浅水俊平特任助教、菅井佳宜特任助教に感謝申し上げます。また、本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成によって設立された東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座にて行われました。

文献
1) Arnison, P. G., Bibb, M. J., Bierbaum, G., Bowers, A. A., Bugni, T. S., Bulaj, G., Camarero, J. A., Campopiano, D. J., Challis, G. L., Clardy, J., Cotter, P. D., Craik, D. J., Dawson, M., Dittmann, E., Donadio, S., Dorrestein, P. C., Entian, K. D., Fischbach, M. A., Garavelli, J. S., Goransson, U., Gruber, C. W., Haft, D. H., Hemscheidt, T. K., Hertweck, C., Hill, C., Horswill, A. R., Jaspars, M., Kelly, W. L., Klinman, J. P., Kuipers, O. P., Link, A. J., Liu, W., Marahiel, M. A., Mitchell, D. A., Moll, G. N., Moore, B. S., Muller, R., Nair, S. K., Nes, I. F., Norris, G. E., Olivera, B. M., Onaka, H., Patchett, M. L., Piel, J., Reaney, M. J., Rebuffat, S., Ross, R. P., Sahl, H. G., Schmidt, E. W., Selsted, M. E., Severinov, K., Shen, B., Sivonen, K., Smith, L., Stein, T., Sussmuth, R. D., Tagg, J. R., Tang, G. L., Truman, A. W., Vederas, J. C., Walsh, C. T., Walton, J. D., Wenzel, S. C., Willey, J. M., van der Donk, W. A.: Nat. Prod. Rep., 30, 108 (2013).
2) Finking, R., Marahiel, M. A.: Annu. Rev. Microbiol., 58, 453 (2004).
3) Onaka, H., Nakaho, M., Hayashi, K., Igarashi, Y., Furumai, T.: Microbiology, 151, 3923 (2005).
4) Donia, M. S., Ravel, J., Schmidt, E. W.: Nat. Chem. Biol., 4, 341 (2008).
5) Lee, S. W., Mitchell, D. A., Markley, A. L., Hensler, M. E., Gonzalez, D., Wohlrab, A., Dorrestein, P. C., Nizet, V., Dixon, J. E.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105, 5879 (2008).
6) Umemura, M., Nagano, N., Koike, H., Kawano, J., Ishii, T., Miyamura, Y., Kikuchi, M., Tamano, K., Yu, J., Shin-ya, K., Machida, M.: Fungal Genet. Biol., 68, 23 (2014).
7) Onaka, H., Tabata, H., Igarashi, Y., Sato, Y., Furumai, T.: J. Antibiot. (Tokyo), 54, 1036 (2001).
8) Ortega, M. A., Hao, Y., Zhang, Q., Walker, M. C., van der Donk, W. A., Nair, S. K.: Nature, 517, 509 (2015).
9) Ozaki, T., Yamashita, K., Goto, Y., Shimomura, M., Hayashi, S., Asamizu, S., Sugai, Y., Ikeda, H., Suga, H., Onaka, H.: Nat. Commun., 8, 14207 (2017).

　

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