酵素工学ニュース　第68号　pp.11-16 (2012)

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１．はじめに
近年、微生物プラットフォームを基盤に付加価値の高い物質・材料を生産する「合成生物学」1) という新しい分野が世界的潮流になっている。微生物細胞を工場に見立てて、目的物質を合成するための代謝経路が合理的にデザイン化された環境低負荷プロセス構築を目指している。最近では、微生物工場 (Microbial Factory) という言葉も市民権を得て、バイオ燃料、ファインケミカルズ、ポリマー素材などを本格的に製造するステージへと移行しつつある。

本稿では、我々が初めて創成した乳酸ベースポリマー合成用の微生物工場について述べる。「乳酸は、微生物の細胞外に排出される。」と、一般の教科書に記述されている。しかし、2008年に乳酸が細胞内でバイオポリマー中に取り込まれるという珍現象が起こった2)。生物史上初めてのことである。ポリ乳酸PLA3)はじめ「乳酸ベースポリマー」が微生物細胞内で生合成できる先駆けとなった出来事である。その契機となったのは、正に酵素工学研究の成果である「乳酸重合酵素」 (Lactate-Polymerizing Enzyme: LPE) の開発 (発見)2)であった。

２．乳酸重合酵素 (LPE) 発見までのプロローグ
多くの微生物がポリエステルを合成することは以前から知られており、最初の報告例は、1926年にパスツール研究所で発見された微生物ポリエステル (polyhydroxybutyrate (P(3HB)) である。P(3HB) のモノマー3ヒドロキシ酪酸 (3-hydroxybutyrate: 3HB) と乳酸は、「ヒドロキシ酸」という基本化学構造を共有しており、主鎖炭素に結合する水酸基の位置が異なっている。微生物ポリエステルは、その構成モノマーが、現在に至るまで3HBを含む150種類以上が報告されており、PHA(polyhydroxyalakanoate)4)と総称されている。

PHAは、植物由来の糖や植物油あるいは二酸化炭素から直接微生物合成できることから、資源循環型の環境調和素材であり、PHAを石油系プラスチックの代替品として利用すれば、カーボンニュートラルという観点でプラスチック産業の環境負荷を軽減できると期待されている。たとえば、PHA研究の初期に報告された水素細菌Ralstonia eutrophaをはじめ多くのPHA生産菌はP(3HB)) を生産する。P(3HB) は、硬くて脆い性質であることから、実用化のためには物性の改善が必要であった。本課題を解決するための先駆的な研究は、3HBモノマーと比べて、炭素鎖が1つ長い3-ヒドロキシ吉草酸 (3HV) モノマーを共重合化したP(3HB-co-3HV) 共重合ポリマー (コポリマー) の生合成であった5)。さらに、第二モノマー成分として3HVよりも側鎖長の長い3-ヒドロキシヘキサン酸 (3HHx) やそれ以上の炭素鎖を含む3-ヒドロキシアルカン酸 (3HA) ユニットを導入し、分率を向上させることで、破壊伸びが向上したより柔軟なポリマーの合成に成功してきた。2011年5月には、国内の�潟Jネカが、P(3HB-co-3HHx) 共重合ポリマー (登録商標：アオニレックス) の千トンスケールでの生産事業を開始した6)。図1に、これらの内容をまとめて示す。

具体的には、PHA重合酵素を人工進化させることによって、望みの物性を備えたPHAポリマーを自在に合成することを目指してきた。その際、幅広い基質特異性を有するPseudomonas sp. 61-3由来のPHA重合酵素 (PhaC1PS) を出発酵素として選定した7)。PHA重合酵素は、図2に示すように活性中心Cysを起点にモノマーがロードされ、二量化した反対のサブユニットとの間で、ポリマー伸長とモノマーロードとが交互に繰り返されながら重合するメカニズムが提唱されている。PhaC1PSは、中鎖からなる3HAユニットの取り込みは容易であったが、3HBユニットの取り込み能力が微弱であるという課題があった。そこで、3HBに対する反応性を強化するための酵素改変をP(3HB) ホモポリマーの蓄積能力の向上を指標に実施した。本酵素は、多くの研究者が挑戦しているのにもかかわらず、立体構造が未解明であり、改変指針を立てることが困難であった。そこで、網羅的な遺伝子変異と機能選択による進化工学的アプローチを応用した8)。

まず、PHA重合遺伝子の全域に対して、1〜2アミノ酸置換が生じるようにランダム変異を導入した。その重合酵素遺伝子を大腸菌でライブラリー化し、ハイスループットスクリーニング法により、高ポリマー蓄積株の取得を目指した。スクリーニング法は、ポリマー生合成量 (3HBに対する反応性) を大腸菌コロニーの発色強度で判定できるプレートアッセイ系を用いた。選抜された変異体は、試験管レベルで培養しHPLCによってP(3HB) 蓄積能を定量的に調べ、変異部位と置換アミノ酸に関する情報を集積した。最終的には、3HBに高活性を示す優良変異酵素 (第一世代) の取得に成功した。図3は、活性および基質特異性に関与する4つの部位の位置関係を模式的に示している。変異に伴う機能の変動だけを頼りに浮かび上がってきたこの推定構造が、いずれ解明されるであろう立体構造とどの程度重なり合うか今から楽しみである。

さらに、得られた変異体のシングル優良変異を系統的かつ合理的に組み合わせた。その結果、P(3HB) 蓄積能力が野生型と比較して約420倍にまで向上する第二世代の優良変異酵素を創製することに成功した9)。得られたこれら進化型PHA重合酵素ライブラリーを用いて、本題であるモノマー組成制御が可能か検討した。その結果、元々の野生型PhaC1PSが合成するコポリマー中の3HB分率が14%であったのに対して、70%まで大幅に増加したコポリマーが合成された。こうして、著者らはPHA重合酵素の分子進化により酵素の基質特異性を変換し、共重合PHAのモノマー組成を広範囲かつ微細に変化させることに成功した。この研究の成果により、用途に応じた組成からなるコポリマーの合成を多くの変異ライブラリーを活用することで、“テーラーメード”に実現できるようになった。

実は、この延長線上に「乳酸ポリマー合成」という地平が突如として目の前に現れてきたのである。ではなぜ、乳酸が重合される事が重要なのかというと、ポリ乳酸 (PLA) がバイオポリマーの中でも透明性や加工性に優れ、最も実用化されている材料だからである。実際、PHAの生合成機構を応用してポリ乳酸を合成しようとする研究は、以前から世界の著名な研究機関で行われていた。先にも述べたように、化学構造から考えれば、乳酸 (2-hydroxypropionate) がPHAファミリーに属す資格十分と考えられるが、近くて遠い存在であった。その中で、我々が手掛けた乳酸を重合させるシステム作りの過程には、いくつかの“偶然の発見”があった。もちろん、最大の発見 (発明？) は乳酸重合酵素である。

３．乳酸重合酵素 (LPE) の発見から乳酸ポリマー微生物工場誕生まで
元々天然モノマー基質である3HB-CoAを重合できるPHA重合酵素が、もし乳酸のCoA体であるラクチルCoA (LA-CoA) も同様に重合できれば、細胞内でポリ乳酸が生合成されるであろう。この可能性を検証するには、PHA重合酵素を精製し、in vitroでのLA-CoAとの反応を測定すればよい。しかし、この方法では乳酸の重合は見られなかった。そこで、我々は学内共同研究で一つの工夫をした。それは、LA-CoAだけでなく3HB-CoAが共存した条件で活性を評価したことである。すると、たちまち試験管の中が白濁しだした。早速、生成したポリマーを分析してみると、3HBポリマー鎖中に乳酸モノマーが組み込まれていることが判明した。つまり、“ある”PHA重合酵素は、乳酸モノマーを単体では重合しないが、共重合体であれば合成できたのである2,10)。

最も重要な点は、“ある”PHA重合酵素が、進化工学的に改変された高活性変異体であったことである。当時6年間かけ、PHA合成酵素のいくつもの高活性変異体を作製していた。これらの変異体は乳酸を重合する事を目的に作成されたわけではなかった。しかし、結果的に、この中の一つの変異体のみが、上述した共重合体の合成条件で、乳酸重合活性を示し、これまで誰も達成できなかった乳酸重合酵素 (LPEと命名) の発見につながったのである。

早速、微生物工場内 (大腸菌) に構築したモノマー供給ルートに加え、今回発見したLPEを遺伝子導入し作動するかを調べた。まず、図4に示すような乳酸ポリマーの生合成経路を大腸菌内に設計した。構成反応ステップは、(1) 乳酸合成、(2) モノマー供給酵素によるモノマー (LA-CoA) の合成、および (3) LPEによる重合である。LA-CoAモノマーは、乳酸脱水素酵素 (LDH) の反応から得る乳酸がプロピオニルCoA転移酵素 (PCT) によってCoAが付加されることで合成される経路を設計した。実際に外来PCT遺伝子を大腸菌内で発現して、LA-CoAをCE/MS分析で検出することにより、乳酸モノマー供給経路の構築を確認した。また、ペアとなる3HB-CoA供給経路としては、これまでの供給酵素遺伝子を用いた反応を利用した。これら供給されたモノマーを最終的に乳酸重合酵素が重合するというデザインである。

果たして、大腸菌体内で合成されたポリマーを抽出し分析した結果、LAユニットが6 mol%導入されたP (LA-co-3HB) コポリマーであることが明らかとなった2)。設計通りに、微生物工場が駆動し出したのである。水系で温和に重合反応が進む本プロセスは、化学合成での重合反応時に用いる有害な重金属触媒や有機溶媒を使用しないで済むことや、高温高圧条件を要求しないことから合成過程での環境負荷の軽減が期待される。

４．高乳酸分率の乳酸ポリマーの合成
プロトタイプ微生物工場では、コポリマー中に存在するLA分率が6%に留まっていたが、さらに分率を向上させることが可能であろうか？当初我々は、モノマー前駆体である乳酸の合成量が、乳酸分率を高める要因になると考えた。実際、嫌気培養による乳酸合成の促進や、乳酸を高生産する代謝改変株などを利用することにより、乳酸分率を50%近くまで上昇させることに成功した11)。そこで、さらに乳酸分率を向上させるために、我々は過去に取得した重合活性を向上させる優良変異を組み合わせて三重変異を有する新たな進化型LPEを創出し、さらに60%まで乳酸分率を上昇させることに成功した12)。しかしながら、この酵素を用いても、ポリ乳酸を合成しようとすると、ポリマーが得られないことから、乳酸の重合にその他のユニットが必要であることが強く示唆された。すなわち、微生物ポリエステルの重合メカニズムの根幹に関わる問題提起となっており、現在詳細な解析を進めている。

５．コリネ菌による超高乳酸分率ポリマーの生産
これまでのポリマー合成実験では、操作性に優れた大腸菌を用いて行ってきた。しかし我々は、コリネ菌を宿主としたP(3HB) の合成系もすでに構築していた。コリネ菌は、安全な実用アミノ酸生産菌としての実績があり、高濃度の糖液を効率よく資化し、また高密度培養が可能であるなどのメリットがある。では、コリネ菌を使っても同様な乳酸ポリマーの生産ができるのだろうか？当初は、この単純な動機で研究を開始したが、得られた結果は驚くべきものだった。なんと乳酸分率が99%を超えるポリマーが合成されたのである。最初、実験をした学生は、3HBのピークが見られないため、「PLAが合成できました！」と報告してきた。しかし、3HBモノマーの必要性を強く認識していた筆者らは、さらに高い感度で分析するように指示した。その結果、極微量ではあるが、やはり3HBが含まれている事が分かった13)。このような高乳酸分率のポリマーは、少なくとも熱的性質に関しては、ステレオコンプレックス形成による融点上昇を含め、化学合成PLAとほぼ同等の値を示した。したがって、材料科学の観点からは、PLAが生合成できたと言ってよい。

これらの結果から、初発原料である乳酸の合成量を増大させること、乳酸重合酵素の活性を強化することなど、「プラス」の戦略だけでなく、対となる3HBモノマーの供給力を制限する「マイナス」の戦略 (押してもダメなら引いてみな！) が有効であることがわかる。

６．高立体選択乳酸重合酵素による高光学純度ポリマーの合成
微生物工場による物質生産の大きなアドバンテージの一つに、立体異性体を非常に高い精度で選択的に合成可能であることが挙げられるだろう。我々が合成した乳酸ポリマーを加水分解して分析したところ、ほぼ100%D乳酸から構成されていた事が分かった11)。すなわち、搭載されている乳酸重合酵素の立体選択性に起因する。ポリエステル重合酵素は非常に厳密なD体選択性を有している事が知られるが、この性質は乳酸の重合にも継承されていた。これは、3ヒドロキシル基質との構造比較から、エステル結合に関与する水酸基とカルボキシル基との位置関係が反転している事を考えるとかなり興味深い事である。ポリ乳酸には、PLLAとPDLAの両光学異性ポリマーを等モル混在して共結晶化させることでステレオコンプレックスを形成し、熱融解温度が向上することが知られており、光学異性体の作り分けが重要である。現在、産業的に生産されているPLAの主流はPLLAであり、微生物工場で生産されるPDLA (に近いポリマー) はステレオコンプレックスのパートナーとしての利用も大変期待できるだろう。表1に、化学合成PDLAと生合成PDLAに関して、構造や物性・機能の観点から比較としてまとめて示した14,15)。大変興味深い対比となっている。

７．多元ポリ乳酸の構造多様性
さて、このようにして合成されたP(LA-co-3HB) やさらには3元モノマーからなるP(LA-co-3HB-co-3HV) コポリマー16) は、ホモポリマーであるPLAともP(3HB) とも異なる新たなバイオポリマーである。では、このコポリマーはどのような性質を持っているだろうか？我々は、ファーメンターで培養生産したポリマーをフィルム化し、機械的性質を調べた。その結果、写真 (図5) に示すような透明なフィルムができ、さらにこのフィルムは、引っ張ると伸長する柔軟性を持っていた。この性質は、PLAとP(3HB) がほとんど伸張性を持たないのと対照的であった。図6に、その典型的な結果を示す。この結果は、乳酸ポリマー合成微生物が、単に化学合成プロセスからの置き換え (プロセスイノベーション) に留まらず、新たな材料を生み出すこと (材料イノベーション) ができることを示している。

この時点から、「ポリ乳酸」から「多元ポリ乳酸」という新たなるカテゴリーが生まれてきた。すなわち、LPEの幅広い基質特異性を利用して、乳酸をベースに多様なモノマーが共重合化されたコポリマーの合成が可能となる。実際、3HB以外の他種モノマーとの共重合体の創製に成功している。表2では、モノマーにおける主鎖構造の多様性に注目している。これまで、3位に水酸基を有する脂肪酸に対しては、150種以上のモノマーに対して重合可能であった。このことは、側鎖の構造多様性にはPHA重合酵素は極めて広い反応性を示すこと意味する。一方、乳酸のように2位に水酸基を有する脂肪酸モノマーに対しては全く重合活性を示すPHA重合酵素が報告されることはなかった。今回の乳酸重合酵素の開発を皮切りに、モノマー基質がグリコール酸17) や2-ヒドロキシ酪酸 (2HB)18) に対しても重合活性を示す変異体が見つかってきている。したがって、多元ポリ乳酸の構造多様性の拡張に大きな寄与をもたらした。現在、生体医療材料として応用されているポリグリコール酸あるいは乳酸とグリコール酸のコポリマーなどが、本格的に微生物工場によってワンポット合成できる時代が始まりつつある。

８．将来展望
LPEの発見により、初の乳酸ポリマー生産用の微生物工場を構築できた。微生物プラットフォームは、大腸菌からスタートし、現在はコリネ菌など他種微生物へと用途に応じて拡張している。これは、微生物工場の強みで、ポリマー生合成用のソフトウエアをターゲット微生物に移植することでフレキシブルに運用できる。今後は原料となる非可食バイオマス資源との組み合わせも考慮し、バイオマス資化性を強化した宿主との組み合わせにより、再生可能な炭素源から高付加価値なバイオポリマーを生産することが目標である19)。例えば、もし原料が二酸化炭素ならば、藍藻やひいては植物体がポリマー生産プラットフォームになる20)。

幸い、今年度からの新プロジェクト (JST-CREST) 「二酸化炭素の効率的資源化の実現のための植物光合成機能やバイオマスの利活用技術等の基盤技術の創出」の一課題が開始することになった。二酸化炭素から一気通貫に高性能・高機能バイオプラスチックを創製する夢のプロジェクト推進に向け、酵素工学の観点からも貢献できたら幸いである。

謝辞
本稿で紹介した研究成果の多くは、北大内共同研究およびトヨタ自動車・豊田中研との産学連携共同研究によって得られたものである。本稿の実験成果は、主に当研究室の松本謙一郎准教授、山田美和博士 (現岩手大学助教)、正瑞文博士 (現味の素社研究員)、宋育陽 (当研究室博士課程学生) によるものである。また、(独) 科学技術振興機構 (JST) のCRESTプロジェクト「二酸化炭素の資源化」の一環として行われた。

文献
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